近日，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组在Science China Life Sciences在线发表了题为Double knock-in pig models with elements of binary Tet-On and phiC31 integrase systems for controllable and switchable gene expression的研究论文，这项研究成功建立了仅需一轮体细胞克隆，即可获得可稳定遗传的药物调控外源基因表达的工具猪模型。 

　　高表达外源基因的基因修饰猪在生物医药和农业领域具有重要的研究和应用价值。在猪体内引入可诱导基因表达系统，可以对外源基因表达进行精准的时空调控，有利于基因功能的深入剖析和拓展基因修饰猪的应用范围。长期以来，由于技术困难，稳定、高效的可诱导表达外源基因工具猪模型一直未能建立。随着基因编辑技术的快速发展，高效构建各种类型的基因突变，包括单基因敲入、单或多基因敲除/点突变的基因修饰猪模型成为可能，这为在猪上构建稳定可靠的可诱导基因表达体系提供了技术保障。 

　　在研究过程中，该团队首先采用双位点定点敲入的策略，借助两种不同的抗性基因表达盒进行细胞筛选之后，结合体细胞克隆获得了四环素（Dox）诱导报告基因表达的工具猪模型。 

　　为了提高后续获得Dox诱导其它基因表达猪模型的效率，在报告基因两侧引入了能被PhiC31重组酶识别的attP位点。在细胞以及克隆胚胎水平均能实现PhiC31介导的基因表达盒式置换，获得Dox诱导其它任意基因的基因修饰猪细胞，由此绕过复杂而又低效的传统基因敲入步骤。据此，该团队建立了过表达EGFP、hKRAS^G12D及OSKM的猪细胞系。 

　　原癌基因KRAS^G12D突变是肿瘤病人中最常见的突变类型之一，条件性表达KRAS^G12D的动物模型在肿瘤研究中占有重要的作用。利用前述Dox诱导基因表达猪模型，该团队进一步建立了Dox诱导hKRAS^G12D（DIK）表达的猪品系。对从DIK猪分离获得的耳朵成纤维细胞及胎儿成纤维细胞进行Dox诱导，发现诱导后成纤维细胞具有更强的增殖能力，提示了其转化成肿瘤细胞的潜力。接着对7月龄的DIK猪进行长期的体内Dox诱导实验，在诱导后第8个月左右，DIK猪鼻子、口腔、阴囊部位出现肿瘤样增生，肿瘤样品表达鳞状细胞癌标志物CK5/6、CK18。进一步转录组测序分析表明，不同部位肿瘤样品间具有更相似的基因表达谱；GO分析富集到了细胞迁移、细胞运动、细胞粘附、细胞周期、细胞群体增殖和细胞通讯等生物过程；KEGG通路分析表明代谢及肿瘤等信号通路发生改变；Ras信号通路相关基因表达分析发现，许多活化Ras的下游效应蛋白，例如AFDN、PIK3CB、RASSF5、TIAM1、RIN1、RALBP1、RAPGEF5、PIK3R2和RALGDS均显著上调。综上，Dox诱导hKRAS^G12D表达可以驱动DIK猪体内肿瘤发生，DIK猪品系是肿瘤生物学研究的有力工具。 

　　此外，可诱导表达外源基因工具猪，也是一种宝贵的基因资源，为后续建立各种用途的猪模型提供了极大便利。双位点敲入猪遵循孟德尔遗传定律，将Dox诱导报告基因表达猪与野生型猪交配扩繁，可获得四种不同基因型(Rosa26^rtTA/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}, Rosa26^WT/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}, Rosa26^rtTA/WTHipp11^WT/WT和Rosa26^WT/WTHipp11^WT/WT）后代。例如，对于Rosa26^rtTA/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}基因型猪，可以将细胞水平的重组酶介导的基因盒式置换与体细胞核移植相结合，培育Dox诱导目的基因表达猪模型；鉴于体细胞核移植低效且昂贵，而基因盒式置换在胚胎中非常高效，因此，也可以采用将phiC31 mRNA和供体DNA直接注射到源自Dox诱导报告基因表达猪群的受精卵的方法培育Dox诱导目的基因表达猪；对于Rosa26^WT/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}基因型猪，可以通过由组织特异性启动子控制的rtTA元件的单位点敲入，培育可用于谱系追踪的组织特异性诱导报告基因表达猪模型；类似地，对于Rosa26^rtTA/WTHipp11^WT/WT基因型，可以通过单位点敲入TRE3G驱动目的基因表达盒，培育Dox诱导表达猪品系。 

　　本研究中，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组金琴博士为第一作者，赖良学研究员和王可品副研究员为共同通讯作者。该研究成果得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省科技计划、海南省重大科技计划、中国科学院青年创新促进会和中国科协青年人才托举工程等项目的资助。 

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　　可诱导外源基因表达工具猪的应用