生命作为自然最美的杰作,其诞生过程令人着迷。在早期胚胎发育阶段,受精卵通过细胞增殖和细胞分化形成囊胚;囊胚在子宫着床后经过原肠运动(Gastrulation)形成外、中、内三个胚层。外胚层将发育成机体的神经、皮肤等组织,中胚层将发育成心脏、血液、肌肉和骨骼等组织,而内胚层则发育成肺、肝、胰腺和肠等内脏器官。因此,外、中、内三胚层的形成过程对于胚胎发育的正常进行十分重要,并影响胎儿是否能够顺利从母体诞生。正如英国著名发育生物学家Lewis Wolpert所说:“人生最重要的阶段不是出生和结婚,甚至不是死亡,而是原肠运动。”原肠运动在进化上非常保守,其机制受到精细而严谨的调控,是最为引人入胜的发育生物学过程。

　　通过经典的细胞标记移植和谱系追踪等方法,发育生物学家在上世纪八九十年代已经初步建立了小鼠胚胎的细胞命运图谱。这些研究发现,细胞的空间位置对于细胞命运具有重要的影响。例如,各胚层的前体细胞在原肠胚形成之前的上胚层中具有特定的空间区域,而当原肠运动完成后,前端外胚层细胞将按照头尾(Cranio-caudal)的次序,发育为大脑及脊髓等具有严谨前后次序的中枢神经系统。然而小鼠早期胚胎发育、特别是原肠运动时期的胚层谱系建立及细胞命运决定的分子机制尚不清晰,亟需从时间和空间尺度,在全基因组层面阐释其调控关系。

　　随着单细胞转录组测序技术的迅猛发展,传统上快速动态变化的胚胎发育过程,获得了类似于分子显微镜一样的利器。借助单细胞转录组测序,多篇针对原肠运动期间细胞命运决定的工作陆续在Nature杂志上发表,形成研究热点。例如John C. Marioni和Berthold Gottgens实验室合作,构建了小鼠原肠运动(E6.5)到器官发生早期阶段(E8.5)的细胞命运变化路径(Pijuan-Sala et al., 2019);同时发表的另一项工作(Cao et al., 2019)研究了小鼠器官发生阶段(E9.5-E13.5)的单细胞转录组情况,鉴定出56种胚胎细胞的发育轨迹;随后Anna-Katerina Hadjantonakis和Dana Pe’er实验室共同在单细胞转录组水平上解析了内胚层细胞的发育路径(Nowotschin et al., 2019);Chan等结合基因编辑技术进行谱系示踪,揭示了原肠运动期间的谱系转换,证实内胚层具有两重起源,分别来自胚外部分和胚胎部分(Chan et al., 2019)。

　　虽然单细胞转录组分析可以重建胚胎细胞的发育轨迹,但缺乏真实的空间信息,无法将发育调控过程中的时间和空间信息联合分析,而细胞在早期胚胎中的空间位置对其发育分化命运又是至关重要的。为解决这一难题,景乃禾课题组及其合作团队多年来在这一领域深耕,建立了一种基于激光显微切割的低起始量空间转录组分析方法(Geo-seq)(Chen et al., 2017),并首先完成了原肠运动中期外胚层的三维空间分子图谱(Peng et al., 2016)，进一步利用该技术对小鼠早期胚胎发育多个时期(E5.5、E6.0、E6.5、E7.0和E7.5)的外、中、内三个胚层构建空间转录组,建立起百科全书式全基因组的时空表达数据库(http://egastrulation.sibcb.ac.cn/)。此数据库实现了小鼠早期胚胎所有表达基因高分辨率的数字化原位杂交图谱,可供其他研究者查询和分析基因的三维表达模式、共表达关系以及根据特征表达模式检索基因等。这是目前国际上关于小鼠原肠运动时期最全面、最完整的交互性时空转录组数据库。

　　  图1. Geo-seq样品收集示意图和二维数据可视化(corn-plot)

　　Geo-seq收取E5.5-E7.5五个时期的上胚层/外胚层和内胚层,收取E7.0和E7.5时期的中胚层。根据胚胎大小和胚胎结构的复杂程度,分不同区域收取。对三维空间转录的基因表达进行平面化展示,构建corn-plot。红色代表高表达,不同的点代表不同的样品。

　　为揭示不同时期、不同空间位置的胚胎细胞在胚层谱系上的联系,研究人员借鉴更具生物学意义、更加稳健的SCENIC数据分析方法(Aibar et al., 2017),结合着床前胚胎的转录组数据,将发育过程中最重要的时间和空间信息联合分析,构建了小鼠早期胚胎发育过程的系统发生树,并从分子层面重构了胚层谱系的发生过程。发育生物学的传统观点认为,内胚层主要由原肠运动过程中原条迁移出来的细胞构成。而这一研究的最新发现是,内胚层细胞可能很早就发生细胞命运特化,三胚层谱系建成时的内胚层与原始内胚层之间存在更紧密的联系。同时发现,部分外胚层和中胚层具有共同的前体细胞。这将指导发育生物学研究人员进一步通过谱系追踪等遗传学方法,研究胚层谱系建立和细胞命运决定,促进干细胞生物学研究人员对神经外胚层多能干细胞的研究,完善体外肝细胞、胰岛B细胞和脊髓神经细胞等器官前体细胞的分化体系,推动细胞治疗和药物筛选工作的发展。

　　 图2. E2.5时期到E7.5时期的空间结构域相似性

　　不同时期的颜色条代表基因表达结构域,MOR-桑椹胚,ICM-内细胞团,Epi-上胚层,PrE-原始内胚层,En-内胚层,E1-内胚层基因表达结构域1,Ect-外胚层,PS-原条,M-中胚层,MA-前端中胚层,MP-后端中胚层。计算结构域之间的相关性,连接线的粗细表示相对相关性大小。

　　为了探索胚层谱系建立过程中的关键信号分子,研究者进行了信号通路富集分析。结合功能实验,首次发现Hippo/Yap信号通路在内胚层谱系发生过程中具有重要作用。同时也找到了许多在胚层谱系发生过程中关键的转录因子。这项工作系统全面地绘制了早期胚胎发育过程中,谱系建立的关键信号调控网络,这将大大推动发育生物学和干细胞生物学对细胞命运抉择的认识,加深对生命运行机制的理解。

　　 图3. 胚层关键信号作用区域及关键转录因子调控网络

　　绘制了小鼠胚胎E5.5-E7.5时期外、中、内三胚层的关键信号通路作用区域;不同颜色代表不同组的转录因子;棕色连接线代表正相关,绿色连接线代表负相关,连接线的粗细代表相关程度;MGI数据库中敲除小鼠表型与原肠运动异常的标注为三角符号。

　　本研究主要由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所景乃禾课题组、中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所韩敬东课题组与中国科学院广州生物医药与健康研究院彭广敦课题组共同合作完成,中国科学院广州生物医药与健康研究院彭广敦研究员、中科院马普计算生物研究所索生宝博士、生物化学与细胞生物学研究所的崔桂忠博士和禹方博士为该论文的共同第一作者,景乃禾研究员、韩敬东研究员和彭广敦研究员为该论文的共同通讯作者。该工作得到了中国科学院动物研究所周琪研究员、悉尼大学Patrick P.L. Tam教授、生化与细胞所化学生物学技术平台、高性能计算存储与网络服务平台和动物实验技术平台的大力支持。这项工作得到了中国科学院战略性先导科技专项、国家重点研发计划、国家自然科学基金委员会、广东省科学技术基金、广州再生医学与健康广东省实验室前沿探索项目、上海市自然科学基金和上海市科学技术委员会的资助。

　　Reference:

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　　2. Cao, J., Spielmann, M., Qiu, X., Huang, X., Ibrahim, D.M., Hill, A.J., Zhang, F., Mundlos, S., Christiansen, L., Steemers, F.J., et al. (2019). The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature.

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　　6. Peng, G., Suo, S., Chen, J., Chen, W., Liu, C., Yu, F., Wang, R., Chen, S., Sun, N., Cui, G., et al. (2016). Spatial Transcriptome for the Molecular Annotation of Lineage Fates and Cell Identity in Mid-gastrula Mouse Embryo. Developmental cell 36, 681-697.

　　7. Pijuan-Sala, B., Griffiths, J.A., Guibentif, C., Hiscock, T.W., Jawaid, W., Calero-Nieto, F.J., Mulas, C., Ibarra-Soria, X., Tyser, R.C.V., Ho, D.L.L., et al. (2019). A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature.