iPS克隆猪

美国培育出的转基因猪

猪对人类做出的贡献的确巨大

　　诞生于1996年7月5日的“克隆羊”多莉，曾被美国《科学》杂志评为“1997年世界十大科技进步”的第一项，也是当年最引人瞩目的国际新闻之一。科学家认为，“多莉”的诞生标志着生物技术新时代的来临。最近几年基因编辑技术发展突飞猛进。如今，科学家已开始利用基因编辑技术改造猪的器官，结合克隆动物技术培育能够为人类捐献器官的猪，用以治疗一些晚期器官功能衰竭疾病。 

　　科学技术的发展，已在逐渐克服各种异种器官移植的难题。如果有一天，你的器官已经衰竭，无法再支持你的生命，你不必苦苦等待那1%的器官移植机会，为你量身打造（基因编辑）的猪器官将为你带来新生。 

　　1、猪是人类器官 最理想的供体对象　

　　自20世纪80年代免疫抑制药物应用以来，临床器官移植就成为晚期器官功能衰竭的首选治疗手段。但器官来源在全世界范围内一直存在严重短缺的问题，人们便想到可以从动物身上来寻找相关器官来源。无论从伦理学、繁殖特性、传染病风险、器官大小和生理学等多方面考虑，猪都是人类器官最理想的供体对象。 

　　只是，猪器官植入人体，存在的一个最大障碍是超急性排斥反应。因此，避免该反应便是异种器官移植的关键。 

　　非灵长类动物的细胞表面有一种被称为是α-1,3半乳糖（即α-Gal）的抗原，在长期的生命进化中，α-Gal在灵长类包括人体中已经消失，但却有针对该抗原决定簇的天然抗体。所以，如果将其它动物的器官和组织移植入灵长类动物，其内在抗体与外来组织器官细胞表面的α-Gal相结合，会引发补体系统的链式激活，能够在几十分钟到数小时之内将外来的移植物杀死。这就产生了“超急性排斥反应”。 

　　最初，人们试图通过一般的转基因技术，生产能降低或掩盖半乳糖基转移酶活性的转基因猪，但效果不明显。只有培育出完全不含α-Gal的转基因猪，才能彻底消除这种排斥反应。自从2002年，赖良学所在的美国研究团队克服了体细胞基因打靶技术和体细胞核移植技术两大技术障碍，成功获得世界首例“半乳糖基转移酶基因敲除的克隆猪”，美国哈佛大学医学院又利用该“半乳糖苷转移酶双基因敲除克隆猪”的器官，移植到狒狒体内。肾脏移植后狒狒存活了83天，另一只心脏移植后的狒狒存活长达6个月（该结果先后发表于《Nature Medicine》上）。随后十几年里，科学家们在“半乳糖苷转移酶双基因敲除猪”的基础上，对猪开展了多基因修饰，以降低人体对猪器官的免疫排斥，猪器官在非人灵长类动物体内的存活时间也越来越长。 

　　今年4月，《Nature Communications》发表了美国国家卫生研究院异种猪心脏移植的突破性进展。该研究小组在“半乳糖苷转移酶基因敲除纯合子猪”的基础上，又获得了一种“三基因修饰转基因猪”。科学家将该转基因猪的心脏移植到狒狒体内，辅助抗体药物治疗，最终使异种猪心脏在狒狒体内平均存活298天，其中一只活了945天，创造了异种器官移植的新纪录。 

　　在异种移植领域有一个共识是，如果猪器官在狒狒身上能够存活一年，就可以开展猪器官的人体移植实验。因此，猪心脏移植入人体的临床实验指日可待。 

　　2、异种胰岛移植或最先应用临床　

　　早在上世纪20年代，医学界就发现了胰岛素的功能。一开始，科学家在狗的身上发现了胰岛素和能够产生胰岛素的胰岛，就觉得它非常有趣——平时不活跃，但一旦周围环境中葡萄糖浓度提升，胰岛就会分泌胰岛素来调控身体各个器官和组织代谢、分解葡萄糖。有了这一理论的支撑，生物医药界、化学界一直在为糖尿病患者寻找最合适的胰岛素来源。 

　　胰岛隐藏在胰腺内，体积微小仅150-400微米大小。人类的胰腺含有75万-200万个胰岛，经过提纯后一般只能保留20万- 50万个胰岛。 

　　上世纪50年代，英国科学家最早测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列，开辟了人类认识蛋白质分子化学结构的道路。1965年9月17日，中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质。但牛的胰岛素与人类自身胰岛素存在着三个氨基酸的差异，因此效价较低，用于治疗时需要更大的剂量，且更容易产生药物依赖(胰岛素越打越多)。 

　　进入21世纪，生物医学技术，已经能够直接产业化生产人胰岛素。但即便是产生出了足够剂量的胰岛素，依然存在着诸多问题。比如使用短效胰岛素，吃了饭就要打一针；长效胰岛素，需要一天打两针，等等。而且患者患病越久，使用的剂量往往越大。所以，从捐献者处获得人类胰岛进行移植，早在1977年就开始尝试了。截至2012年，全世界一共有1400人接受了人胰岛同种异体移植，但移植成功率也就只有58%的水平。胰岛移植本身在技术上没有什么难度，与其他器官移植如肝移植、肾移植相比，胰岛移植属于细胞移植，移植风险也相对微小。只是胰岛器官来源非常有限。 

　　来源于人类的胰岛捐献太过稀少，医学界就将目光投向了其它动物。比如同为哺乳动物的猪、牛等。它们与人类在基因层面的相似度非常高，超过80%。具体到胰岛、胰岛素层面，差异就更加小。来自中国、新西兰的医生一直在进行动物源性的胰岛移植研究。比如中南大学湘雅附三院的王维课题组对22例施行“猪-人”胰岛移植的糖尿病患者进行复查，结果显示：手术后20例患者的胰岛素使用量减少了30%以上，属“有效”；其中6例减少了50 %以上，达“显著疗效”，其中1人脱离胰岛素达一周之久，为“暂时治愈”。这一研究的关键在于，直接移植猪的胰岛，生物安全性问题并没出现。用了猪胰岛的患者，也并没有因此更容易得猪流感或更容易感染猪链球菌。只是这种治疗糖尿病的效果仍不如人胰岛移植，毕竟两者存在一个氨基酸的差异。 

　　近日，湘雅医院有关团队又将诱导免疫耐受新技术应用到了猪胰岛异种治疗糖尿病，达到了非常接近人同种异体胰岛移植临床疗效。该研究获得的“纯合子人源化胰岛素基因修饰猪”，将为糖尿病的治疗提供人胰岛素，同时也将为临床异种胰岛移植治疗提供更为理想的供体来源。目前，赖良学研究团队也正通过克隆技术和正常的动物繁育技术加快该“人源化胰岛素基因修饰猪”的繁殖，尝试通过修改猪胰岛素编码基因，使其直接编码生产出人胰岛素，期望在2-3年内进行非人灵长类动物的猪胰岛移植试验后正式进行临床试验。 

　　3、“基因修饰猪”后代都是“亲人猪”　

　　日前，中科院广州生物医药和健康研究院赖良学课题组，在对小猪特定基因进行精准的修饰后，让该小猪和其子代、孙代出生的小猪都变成了这种能分泌人类胰岛素的“亲人猪”。 

　　在对30-35天的小猪胎儿进行处理后，研究人员可先期得到小猪的成纤维细胞。对获得的小猪成纤维细胞特定基因进行精准的修饰后，通过克隆技术，用基因编辑后的成纤维细胞替换猪卵子的细胞核，由此就能生成的新的猪克隆胚胎细胞，然后再植入到母猪的输卵管中。剩下的怀孕、分娩工作，就由小猪的母亲自己完成。 

　　要满足医学临床试验用途，还需要扩大繁殖这一种类的猪群。毕竟一个I型糖尿病患者进行的胰岛移植，可能需要20头左右的小猪来提供。只有扩大繁殖后，无论是用这些猪来生产人胰岛素也好，还是只提纯猪的胰岛用来进行胰岛移植手术也好，都会更加便利。 

　　这一技术还在后续研究中，下一步，研究人员希望能够在猴子这一灵长类动物身上进行基因编辑猪胰岛的移植试验。然后有望在5年内进入临床试验，随后进入临床应用。目前该课题组的相关研究已在线发表在国际知名的《分子细胞生物学杂志》上。 

　　其实现代医学发现，人类所有的遗传性疾病中，大多数疾病属于明确的基因点突变疾病。在明确了发病原理后，科学家们已经能通过猪等其他生物来模拟人类的疾病了。通过基因编辑技术，甚至可以让猪也患上地中海贫血、帕金森、衰老等疾病，然后利用这些患“人病”的猪替人试药，最终选出有效的治疗药物和治疗策略，反过来治人病。这就是“模式生物”在为现代医学界选药过程中发挥的巨大作用。 

　　（本文来源：中科院广州生物医药与健康研究院） 

　　渐冻人症相关的研究——渐冻猪　

　　早前流行一时的“冰桶挑战活动”，就是为呼吁全世界关注“渐冻人”而发起的。肌萎缩侧索硬化症，俗名就是“渐冻人症”，是一种无法治愈而且致命的神经退行性疾病。患者在临床上表现为上、下运动神经元混合受损，导致球部、四肢、躯干、胸部和腹部的肌肉僵直、颤搐并逐渐萎缩，最终患者因吞咽和呼吸困难而死亡。 

　　目前已知的渐冻人症的致病基因主要为SOD1、TDP-43、FUS等。然而，转基因小鼠模型的研究一直难以模拟病人这一典型的病理变化。中科院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组与中科院遗传与发育生物学研究所李晓江研究组，利用体细胞核移植的方法，曾成功地建立“转基因亨延顿舞蹈症猪”和“转入突变SOD1基因的渐冻人症猪”模型。 

　　后来，他们合作建立了“转基因TDP-43西藏小型猪”模型。该转基因猪表现出“渐冻人”的症状，同时存在类似人类疾病患者中神经细胞质TDP-43聚集的现象。此研究不仅揭示了TDP-43的新型致病机理，也提示大动物模型更能表现出与病人病理变化较为接近的特征。 

　　相关人体实验仍未获批准　

　　华尔街时报最新消息称，在美国，已有超过12万人在等待着器官移植，却没有足够的捐献者。这种严重的短缺让研究人员将一个不寻常的解决方案提上日程：用转基因猪提供器官用于人体移植。 

　　其实这项异种移植的研究已进行了几十年。去年美国哈佛大学一组科研人员发表论文称，他们使用一种新的基因编辑技术CRISPR-Cas9，已能基本敲除猪基因中的病毒残余物质。因此，如今甚至有消息称，美国有可能明年就会开始在人体上进行相关实验。 

　　但国际异种移植协会今年更新了声明，说在进行人体临床实验之前，已获得改良的转基因猪的胰岛的异种动物，至少需要存活六个月或更长的时间。他们当然希望第一名参与实验的病人就能获益，但毕竟我们还不知道猪基因里是否还携带某些未知病毒，可能对猪无害，或者对其它动物也无害，却可能会感染人类。目前美国食品和药物管理局对启动人体临床试验这一申请的态度仍是保守的：这种异种移植最多只能限于那些患有某些疾病严重至危及生命的人，前提还应该是其他治疗方式已不足以对其进行医治。 

　　不过参与相关研究的Tector博士说，对于一些年纪较大的患者来说，可能在去世前都等不到一个相匹配的可供移植的器官，那么尝试移植一个转基因猪的器官也未尝不是一件好事。（那拉）　　 

　　第一头克隆猪的诞生　

　　链接 

　　由于猪的生理特征、组织细胞结构和人类十分类似，因此猪等大动物的基因修改、诱导多能性干细胞（iPS）等研究受到世界各国科学家的重视。 

　　2002年，赖良学所在的美国研究团队成功获得世界首例“半乳糖基转移酶基因敲除的克隆猪”。这是全世界第一头“基因敲除猪”（或称“基因打靶猪”）。2011年，任职于中科院广州生物医药与健康研究院的赖良学博士、浙江大学肖磊博士和华大基因研究所杜玉涛博士等的共同努力下，赖良学课题组又率先获得了全世界第一头的成活的“iPS克隆猪”。 

　　获得基因打靶的iPS细胞之后，一方面可以通过嵌合体技术，获得生殖系嵌合的动物，再经过交配获得“基因修饰动物”；另一方面，可将这些基因打靶iPS细胞为核供体，通过核移植技术获得“基因修饰克隆动物”。赖良学通过长期开展人和动物胚胎干细胞的分离培养、转基因动物的建立、动物克隆及人类治疗性克隆等研究，已发表相关论文100余篇，并成功地建立了30余种在生物医药和农业领域具有重要用途转基因猪。□李小平 

　　原载于《羊城晚报》（2016年12月03日 B4版 晚会）